W ramach projektu wykonano wszystkie przewidziane do realizacji zadania. W szczególności uzyskano dostęp do wiedzy z sekwencjonowania nowej generacji i analizy danych poprzez wykonanie eksperymentu sekwencjonowania, przez Pracownię Sekwencjonowania DNA i Syntezy Oligonukleotydów, Instytut Biochemii i Biofizyki PAN, Warszawa. Sekwencjonowanie odbyło się w dwóch etapach, na miejscu w PRz w Rzeszowie dzięki osobistemu zaangażowaniu Pan mgr Jana Gawora, głównej osoby realizującej eksperyment. Było to pierwsze sekwencjonowanie metodą Oxford Nanopore na Politechnice Rzeszowskiej wykonane w dn. 17-23.06.2020 r. W dn. 08.06.20 odbyło się spotkanie przygotowujące ten eksperyment. W spotkaniu wzięli udział dr Marta Sochacka-Piętal oraz mgr Małgorzata Semik (Zakład Biotechnologii i Bioinformatyki/WCh PRz), mgr inż. Michał Wroński (Zakład Systemów Złożonych/WEiI PRz), mgr Jan Gawor, Pracownia Sekwencjonowania DNA i Syntezy Oligonukleotydów, Instytut Biochemii i Biofizyki PAN, Warszawa. Eksperyment podzielono na dwie części – doświadczalną oraz bioinformatyczną, realizowane odpowiednio, w Zakładzie Biotechnologii i Bioinformatyki Wydziału Chemicznego oraz w Zakładzie Systemów Złożonych Wydziału Elektrotechniki i Informatyki. Sprawne przeprowadzenie sekwencjonowania, jak również prawidłową analizę bio-informatyczną uzyskanych danych, nadzorował mgr J. Gawor. Niezbędnej pomocy organizacyjno-technicznej udzielił także prof. dr hab. inż. Mirosław Tyrka z WCh. W części drugiej, bioinformatycznej, wymagane było zaangażowanie pozostałej części zespołu projektowego, w tym dr inż. Dominik Strzałka, dr Michał Piętal, mgr Magdalena Totoń, mgr inż. Michał Ćmil i mgr inż. Anna Czmil. Eksperyment trwał 5 dni roboczych: pierwsze dwa dni dotyczyły pracy w laboratorium mokrym, pozostałe dni przeznaczono na prace o charakterze bioinformatycznym w tym na analizy danych oraz ich przetwarzanie na serwerach Zakładu Systemów Złożonych.
Realizacja serii eksperymentów sekwencjonowania nie byłaby możliwa bez zakupów niezbędnego wyposażenia tj. MinION Starter Pack (łącznie 7 szt.) wraz z wyposażeniem dodatkowym w postaci tzw. kits.: CN1398 First Release Rapid barcoding Kit, Native Barcoding Expansion 112, Native Barcoding Expansion 1324, RAP Top Up Kit, Flow Cell Priming Kit oraz SPOT ON FLOW CELL MK 1 R9 VERSION, Field Sequencing Kit, Flow Cell Priming Kit, użycia kaset Blue Pippin, enzymu DNAza oraz wynajmu urządzenia Blue Pippin.
Ponadto w ramach projektu wyhodowano nowe mutanty termotolerancyjnego szczepu Bacillus subtlis MSP4 otrzymane na drodze mutagenezy chemicznej z wykorzystaniem bromku etydyny. Dla otrzymanych mutantów wykonano proces sekwencjonowania metodą ONT. Uzyskano pulę kilkunastu mutantów o zmienionej sekwencji genów, kodujących enzymy o potencjalnym zastosowaniu komercyjnym, takich jak proteazy, desaturaza kwasów tłuszczowych, hydrolaza epoksydowa czy subtylizyna E. Na podstawie przeprowadzanych analiz bioinformatycznych (adnotacja uzyskanych sekwencji genomowych szczepu dzikiego oraz otrzymanych mutantów z wykorzystaniem narzędzi serwera RAST) wytypowano do opatentowania szczepy mutantów B.subtilis MSP4, wytwarzających zmutowane enzymy.
Wykonano także szereg niezbędnych prac informatycznych pozwalających na implementacje zarówno od strony programowej jak i sprzętowej serwera NanoForms do przetwarzania i analizy surowych danych bioinformatycznych. Przygotowany serwer (dostępny pod adresem http://nanoforms.tech) jest w stanie obsłużyć małe genomy (do 50 MB). Użytkownik serwera ładuje zarchiwizowany, pojedynczy plik sekwencji (fastq), następnie dane są wstępnie przetwarzane a użytkownik na bieżąco wybiera dostępne opcje, co pozwala na uzyskanie sekwencji DNA/RNA w postaci pliku fasta. Dla serwera NanoForms opracowano autorski algorytm pipeline przetwarzania danych z ONT. W czasie budowy serwera, ponadplanowo rozszerzono jego funkcjonalność o tzw. złożenie hybrydowe (wraz z danymi z urządzenia Illumina ), co znacząco poprawia ostateczną jakość sekwencjonowania. Opis całego serwera zostanie przedstawiony w publikacji (do zgłoszenia w czasopiśmie z IF) pod roboczym tytułem "NanoForms: an integrated server for processing, analysis and assembly of raw genomic data of prokaryotic species, from Oxford Nanopore technology".
Jeden ze studentów pracujących w projekcie, Pan mgr inż. Michał Ćmil, po zakończeniu projektu oraz obronie pracy dyplomowej został zatrudniony od października 2020 w Politechnice Rzeszowskiej w Zakładzie Systemów Złożonych.
Zespół projektowy uważa, że grant zakończył się powodzeniem.
Projekt był finansowany przez Podkarpackie Centrum Innowacyjności w ramach grantu nr F3_116 (umowa nr 05/PRZ/1/DG/PCI/2019).
W załączeniu pełne sprawozdanie z realizacji projektu.
Raport koncowy (748.62 KB, pdf)
